Analisa Protein

A. Fungsi Protein

o Zat pembentuk sel baru

o Zat penyusun sel seperti; nukleoprotein, enzim, hormon, antibodi, dan kontraksi

o Zat pengganti sel rusak

o Sumber energi (4 kkal/gram)

B. Pengertian

o Polimer dengan asam amino sebagai monomer-monomernya.

o Polipeptida rantai panjang dengan salah satu ujungnya berupa asam karboksilat dan ujung lainnya gugus amina.

o Makromolekul (BM > 40.000) dan termasuk juga kelompok makronutrien.

C. Pengujian

o Kualitatif

1. Biuret

Protein + (CuSO₄++NaOH 20 %) à biru lembayung

2. Millon

Protein + Hg₂(NO₃)₂ à merah (gugus fenol pada asam amino tirosin)

3. Ninhidrin

Protein + pereaksi ninhidrin à biru lembayung

o Kuantitatif

1. Volumetri

– Kjeldahl

Mengukur kadar protein total berdasarkan jumlah nitrogen yang terdapat dalam sampel à cocok untuk protein tak larut atau terkoagulasi akibat pemanasan dalam pengolahan.

Prinsipnya ialah melakukan tiga tahap pengujian, yaitu :

– Destruksi : mengubah N dalam protein menjadi (NH₄) ₂SO₄

– Destilasi : memecah (NH₄)₂SO₄ à NH3 ditangkap oleh asam

– Titrasi : mengukur sisa asam yang tidak bereaksi dengan NH₃

Kadar protein akhir dihitung berdasarkan rumus sbg berikut :

= V NaOH (blanko) – V NaOH (sampel) x N NaOH x 14,008 x 100% Fk

sampel (mg)

– Titrasi Formol

Gugus amina diikat oleh formaldehid, sehingga protein menjadi bersifat asam à dapat dititrasi menggunakan basa NaOH à cocok untuk produk susu.

2. Gasometri

Protein + asam nitrit menghasilkan gas N2 à dimurnikan dengan kalium permanganat kemudian dapat diukur volumenya dalam satu tempat tertentu. Metode ini lebih selektif daripada metode Kjeldahl disebabkan hanya bereaksi dengan gugus amin alifatik primer saja.

3. Spektrometri

Metode ini tepat digunakan untuk sampel yang mengandung protein terlarut, seperti pada produk-produk hasil ternak (telur dan daging) serta biji-bijian yang belum mengalami perubahan akibat pemanasan/pengolahan. Ada dua jenis sinar yang digunakan dalam metode ini, yaitu menggunakan sinar UV atau sinar tampak (visibel). Adanya gugus aromatik pada asam-asam amino seperti fenilalanin, tirosin, dan triptofan dapat menangkap sinar UV. Adapun jika menggunakan sinar tampak, maka terlebih dahulu diperlukan penambahan pereaksi, seperti tiga (3) macam reaksi berikut :

– Metode Biuret

Reaksi antara ikatan peptida dalam protein dengan logam Cu pada suasana basa menghasilkan komplek warna biru yang dapat diukur secara spektrofotometri pada λ 540 – 560 nm. Metode ini tepat untuk produk tepung-tepungan, gandum, darah, dan anggur.

– Metode Folin Ciocalteu

Metode ini didasarkan pada reduksi pereaksi Folin (asam fosmolibdat dan asam fosfotungsat) oleh gugus fenol pada tirosin dan triptofan menghasilkan molibdenum warna biru yang dapat diukur secara kolorimetri/ spektrofotometri. Cara ini relatif lebih cepat dan lebih peka, namun warna yang dihasilkan kurang stabil

– Metode Lowry

Metode ini merupakan pengembangan dan penggabungan dari metode Biuret dan metode Folin yang dilakukan oleh Lowry kurang lebih 45 tahun yang lalu. Adanya inti aromatis pada asam amino tirosin, triptofan, dan fenilalanin akan mereduksi kedua macam perekasi Lowry A (asam fosfomolibdat : asam fosfotungsat 1:1) menjadi molibdenum yang berwarna biru yang selanjutnya ditambahkan perekasi Lowry B (CuSO4 + Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1 N + K Na-tatrat 2%) sehingga menghasilkan warna yang lebih stabil dan dapat diukur absorbansinya pada λ 600 nm. Metode ini lebih senditif daripada metode Biuret.

4. Spektrofuorometri

Asam amino tirosin dan triptofan dapat berfluorosensi pada λ eksitasi 280 nm dan λ emisi 348 nm. Keuntungan metode ini ialah lebih sensitif daripada menggunakan spektrofotometri UV karena dalam kadar yang lebih kecil mampu membrikan respon yang lebih tajam, serta lebih selektif karena tidak semua senyawa dapat berfluorosensi.

5. Tubidimetri

Metode ini didasarkan pada kekeruhan, dimana protein dalam suatu sampel dapat diendapkan dengan ditambahkan bahan pengendap protein, seperti asam trikloroasetat, kalium feri sianida, dam asam sulfosalisilat. Kurva baku dapat dibuat untuk mengubungkan antara tingkat kekeruhan sampel dengan kadar protein dalam sampel. Semakin tinggi tingkat kekeruhan sampel menunjukan semakin tinggi pula kadar proteinnya. Metode ini jarang dilakukan.

6. Pengikatan Zat Warna

Adanya gugus polar dalam protein dapat mengikat zat warna yang bermuatan berlawanan dengan muatan protein membentuk komplek warna yang tak larut. Zat warna yang sering digunakan ialah zat warna asidik seperti Amino Black 10B (λ maks 615 nm) dan Orange G (λ maks 485 nm) karena memiliki 2 gugus –SO3H (negatif) sehingga akan berikatan kuat dengan gugus amina yang bersifat basa dari protein.

7. Kromatografi

– Kromatografi Kertas dan Krom.Lapis Tipis

Metode ini sudah jarang dilakukan dengan ditemukannya metode lain yang lebih peka dan sensitif serta memiliki tingkat akurasi yang lebih tinggi, seperti KCKT dan KG.

– KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

Metode ini merupakan penyempurnaan dari metode-metode yang telah ada, seperti spektrofotometri UV dan sinar tampak yang tidak mampu mendeteksi asam-asam amino yang tidak memiliki gugus aromatis. Untuk dapat mendeteksinya, diperlukan satu perlakuan tambahan terlebih dahulu, yaitu dengan menderivatisasi menjadi asam-asam amino yang dapat dideteksi (berfluorosen). Oleh karena itu, penting disini ialah pemilihan satu perekasi penderivat, yaitu yang memiliki syarat-syarat minimal, seperti :

– Mampu menghasilkan produk yang dapat ditangkap oleh sinar UV maupun sinar tampak (sepktrofotometri) ataupun dapat membentuk senyawa berfluorosen sehingga dapat diukur dengan spektrofulorometri.

– Mampu menghasilkan produk sebesar mungkin (100%)

– Mampu menghasilkan produk yang stabil selama prose derivatisasi mampun deteksi.

Beberapa pereaksi penderivat yang dapat digunakan, diantaranya ialah PITC (Fenil isotiosianat), BITC (Butil isotiosianat), OPA (o-ftalaldehid), dan AQC (6-aminokuinolil-N-hidroksisuksinimidil-karbamat)

– Kromatografi Gas

Dalam metode ini juga diperlukan satu perlakuan awal untuk menderivatisasi menjadi senyawa yang lebih volatil atau dapat menguap.

Referensi :

– Rohman, Abdul dan Soemantri, 2007, Analisis Makanan, UGM Press, Yogyakarta